▲图片来源：Aimee Silla

如今，包括蛙类在内，两栖动物的灭绝速度超过了世界上的任何其他脊椎动物。科学家和环保人士为它们建立了多个人工繁殖基地，却依旧无法缓解这种趋势。如何使濒危物种中仅剩的几只繁殖后代，缓解物种危机成为新的难题。但随着育种技术的发展和人造栖息地的多样化，未来或许我们还能听到一些濒危蛙类的叫声。

大量蛙类步入濒危

几年前，我意外地收到了朋友的一封邮件。这位朋友是蛙类爱好者，他在邮件中写道：“Toughie死了。”Toughie是一只巴拿马树蛙（Rabb's fringe-limbed tree frog），这只树蛙曾在全球拥有众多的粉丝，而我也是其中之一。Toughie长得非常可爱，但它却因为一个残酷的事实而出名：它是世界上最后一只巴拿马树蛙。作为灭绝危机中种群的唯一幸存者，Toughie经历了众星捧月但又十分短暂的一生。

▲Toughie（图片来源：wikipedia）

2005年，一个动物保护小组从巴拿马一处偏远的云雾森林中，捕获了Toughie和另外4只巴拿马树蛙，并将它们带到美国进行人工繁殖，希望以此来阻止巴拿马树蛙的灭绝。由于蛙壶菌的感染，该物种很快就从野外消失了，随后人工繁殖也宣告失败。到2012年，Toughie成了最后的幸存者，而它也于2016年9月去世。虽然我们早就知道Toughie终将离去，但这并不能够减轻我们受到的打击。

今年，我一直关注着一只来自玻利维亚的西温克斯水蛙（Sehuencas water frog）的命运。这只英俊的水蛙名叫Remeo（罗密欧），十年来独自生活在玻利维亚的科恰班巴自然历史博物馆的水族馆里。它曾反复尝试寻找伴侣，但均未成功。2017年底，Remeo放弃了对异性的呼唤，它似乎注定要面临与Toughie相同的命运。幸运的是，由于网络上其他人的帮助，这只西温克斯水蛙有了避免孤独终老的机会。

去年情人节的那天，Remeo的饲养员在网站上发布了Remeo的资料。这一举动带来的大量捐款，资助和支持了另一支探险队的野外水蛙寻找工作。今年1月，博物馆宣布探险队发现了5只水蛙，其中包括2只雌性。鉴于野外黯淡的生存前景，探险队把它们带回了水族馆。Remeo终于找到了属于自己的另一半，而它被取名为Juliet（朱丽叶）。

▲Remeo（图片来源：美国物理学会）

每个春天，我家后院的青蛙似乎会抓住一切机会大量产卵，所以我天真地猜测Remeo的“婚后”生活也会十分顺利，并热切期待着小蝌蚪们的消息。然而结果不容乐观，被圈养的水蛙似乎并没有太大的繁殖热情。如果西温克斯水蛙这样的濒危动物不进行交配产卵，怎样才能拯救它们呢？

对于蛙和蟾蜍来说，我们可以用生殖技术来解决这一问题。随着两栖动物激素疗法、人工受精和冷冻保存技术的迅速发展，人工圈养蛙类诞下健康后代的机率也开始提高。而目前受益于这些技术的濒危物种还很少，但正如澳大利亚伍伦贡大学的生殖生物学家Aimee Silla所说，这些技术预计能为更多的濒危动物提供帮助。Silla和同事Phillip Byrne在《动物生物科学年度评论》中报道了该领域取得的成就。她说：“这些技术具有很大的应用潜力，而且激动人心的突破层出不穷，因此我们有理由保持乐观。”

地球上的生物多样性正在以空前的速度削减，而两栖动物首当其冲，其数量减少速度超过了任何脊椎动物群体。2017年，世界自然保护联盟（IUCN）列出了大约2100种濒临灭绝的两栖动物，几乎占已知两栖动物物种的32％。根据IUCN的估计，这一数字可能还会继续上升至55％左右。

其实我们很熟悉两栖动物数量锐减的幕后元凶——栖息地消失、气候变化、环境污染、被作为食物过度掠取和愈演愈烈的野生动物贸易。但现在还加上有史以来最严重的两栖动物传染病，即壶菌病（chytridiomycosis）。最近，科学家对该病的影响进行了评估，结果表明，这种可怕的真菌感染疾病导致了500多种两栖动物的数量减少，更有90种两栖动物因此灭绝。

20世纪80年代后期，爬虫学家首先敲响了物种灭绝的警钟，并最终促成了科学界对蛙类、蟾蜍及它们的近亲进行的全球评估。2004年发布的结果令人震惊：各地的两栖动物数量都在直线下降，一些物种甚至已经消失。2005年，国际专家举行了一次峰会，以制定相应的保护措施。其中一项重要的提议是，动物园、水族馆和其他有能力的组织应设法“拯救”濒危物种和进行圈养繁殖。

倘若一切顺利，这些“人造保护性栖息地”将在一定程度上保留濒危物种的遗传多样性。如果有合适的栖息地，剩余的后代可以被放归野外，帮助增加或者恢复日渐减少的种群数量。

在这项计划中，许多环境保护人士带回了珍稀的蛙和蟾蜍，被圈养的两栖动物数量激增。其中的一些繁殖计划取得了巨大的成功。例如，马略卡岛产婆蟾（Mallorcan midwife toad）已在野外重新建立了18个繁殖种群，脱离了濒危物种的清单。坦桑尼亚的奇罕西喷雾蟾蜍（Kihansi spray toad）于2009年被宣布在野外灭绝，因为当地的一个水利项目破坏了它们在奇罕西峡谷瀑布旁的、充满水雾的栖息地。于是人们设法为圈养繁殖的喷雾蟾蜍，制造了适合生存的水雾环境，而这一努力也得到了回报，成千上万人工饲养的喷雾蟾蜍被放归到了奇罕西峡谷的人造水雾栖息地中。

▲马略卡岛产婆蟾。（图片来源：维基百科）

辅助生殖技术

但对于其他许多被拯救的物种来说，情况就不太乐观了。有些物种无法产生卵子或精子，或雌雄个体产生配子的时间不同步；有些物种不能进行必要的交配行为；还有少数物种产生了胚胎，但胚胎很难进一步发育。密西西比州立大学的保护生物学家Andy Kouba曾研究过一些美国最罕见的两栖动物，他表示，现在除了灭绝危机外，还存在圈养繁殖危机。

为什么对两栖动物繁殖后代如此艰难？很大程度上，这主要因为我们不够了解稀有物种繁殖的苛刻要求。蛙和蟾蜍是极其多样化的动物，通常具有许多高度分化的繁殖策略和习性。它们有些在水中繁殖，包括平静的湖泊、湍急的溪流及浅浅的水池；另一些则在陆地上繁殖，从热带雨林的地面和树冠，高山沼泽的苔藓下到芦苇丛的泡沫水池中。它们多数会通过体外受精方式繁殖，但也有一小部分是体内受精。有些是一夫一妻制，有些则采用非常混乱的多对多交配方式。

更重要的是，与交配有关的生理和行为变化会与一系列环境和社会因素相联系，包括湿度、温度或压力的变化，更明亮、更长的白昼，同伴的呼唤，冬眠的结束，或一场突如其来、标志着雨季开始的倾盆大雨。一旦某个物种濒临灭绝，我们就几乎没有机会在野外对其进行研究，因此很难找到交配的触发因素。“有些时候我们可以弄清楚交配的诱因，并成功让它们进行交配，但是对于很多其他物种，无论我们怎么尝试也找不到正确答案。” Kouba解释道。

因此三种辅助生殖技术（ART）应运而生：（1）激素治疗，该方法可以促使不情愿的伴侣进行交配，或诱导卵子和精子的发育和释放；（2）体外受精，增加后代的数量和多样性；（3）精子或卵子冷冻技术，以备不时之需。

少数濒危物种已经从这三种技术中受益。例如，在澳大利亚，激素治疗将不愿意配对的科罗澳拟蟾（northern corroboree frog）变成了热情似火的恋人，这样能确保它们都为下一代贡献了自己的基因。来自美国拉勒米平原的怀俄明蟾蜍（Wyoming toad）在野外已灭绝，但多亏了激素和人工受精技术，它们的种群数量又开始恢复。另外，冷冻的精子也为落基山脉南部濒临灭绝的西部蟾蜍（Anaxyrus boreas）贡献了一些后代。

▲西部蟾蜍。（图片来源：维基百科）

但是要完成这些工作其实并不容易。尽管近70年来科学家一直在开展一些基础研究，来使用激素和体外受精技术培育两栖动物胚胎，但到了20世纪90年代，当生物学家试图借助这些技术来增加更多的两栖动物数量时，他们发现实验室的那套流程只适用于特定的对象，因而无法在野外直接采用。经过数年对激素剂量的调整和测试，第一种有效的治疗方法才最终确立。另外，哪怕只是将精子和卵子融合这样的简单任务，也耗费了不少精力。

随着人造保护性栖息地数量的迅速增加（许多仍然无法进行自然繁殖），人们的紧迫感日益增强。“我们意识到，这项研究必须抓紧进行，”Silla表示。而现在，辛苦的工作得到了回报。她补充说：“近年来，辅助生殖技术发展得很快。”

激素疗法之所以能够刺激性腺成熟以及卵子和精子释放，主要依靠两种激素注射：促性腺激素释放激素和人绒毛膜促性腺激素（一直到20世纪70年代，这些激素实验主要为了研究人类的妊娠行为）。有些物种对第一种激素的反应最好，而另一些物种则更适合第二种，同时注射剂量和方案也至关重要。Kouba表示：“每个物种都不相同，因此要找到合适的激素并确定治疗的时间和频率可能要花费几年的时间。”长期以来，为新物种找到合适的治疗方案就是一个试错的过程。如今，对于大约20个物种，科学家们已经确定了相应的激素疗法。

随着激素治疗方案数量的增加，一些规律渐渐浮出水面，而这有助于科学家们找到更多合适的激素疗法。例如，两栖动物的祖先谱系似乎决定了激素的选择，一些蛙类和蟾蜍家族的成员对第一种激素的反应更好，而其他家族的成员则更适合第二种激素。

Silla和Byrne认为，演化因素也可能成为预测最佳精子收集时间的关键，因为雄性产生精子的数量及其释放速度与物种的交配策略息息相关。

在非一夫一妻制的物种中，雄性之间的竞争推动了睾丸向更大的方向演化，它们会产生更多的精子并更快地将其释放。例如西澳大利亚的佐治亚索蟾（它的别名叫quacking frog，因为它会像鸭子一样嘎嘎叫）是一妻多夫制，许多雄性成群聚集在一个产卵雌性周围。那些雄性有巨大的睾丸，里面充满了数以万计的精子。注射激素后，它们会在数分钟内开始释放精子。不过，Silla发现最佳的收集时间是在注射7个小时后，那时精子的释放量会达到峰值。

与之形成鲜明对比的是澳洲南部夜宴蛙（southern corroboree frog），它是生活在新南威尔士州雪山的的极度濒危物种。这种青蛙采取一夫一妻制，这也意味着它不需要产生很多精子，也不必对交配感到着急，因此它的睾丸很小。根据Silla和Byrne的说法，在注射激素后，他们要等待很长时间才能获得精子。Silla说：“在这种蛙中，需要注射36个小时后才能达到精子释放的峰值，而我们最终也只收集到了几百个精子。”

▲澳洲南部夜宴蛙。（图片来源：the conversation）

配子收集后，需要的第二种技术是体外受精，它能够让育种者控制后代的亲缘关系，从而可以在小群体优化遗传多样性。虽然理论上听起来很简单，实践中却并不容易。传统的方法是将卵子和切碎睾丸中获得的精子放入培养皿中混合静置几分钟，然后用水淹没它们。溶液突然被稀释会促使精子变得活跃。

但是在保护动物时，我们不能直接去获得睾丸。取而代之的是，育种者必须等精子移动到泄殖腔并与尿液混合后才能收集它们。对于某些蟾蜍，只要把它们拎起来并放到盘子上，它们就会排出精液和尿液的混合物。如果这样做不起作用，则可以通过对腹部施加轻微的压力。蛙类则更难获得精子，育种者可能需要使用细导管来完成收集工作。

此外，育种想要获得成功还取决于精子和卵子的混合比例是否正确，是否加入了激活精子的特定液体，以及其他很多原因。

第三种技术，也就是冷冻保存技术，同样可以提高种群数量并确保濒危物种的遗传基因健康。因为接受激素疗法的两栖动物通常产生精子和卵子的时间不同步，冷冻保存技术可以先存储一种性别的配子，直到我们获得另一种性别的配子。

精子的长期储存也为遗传多样性的优化开辟了新的可能性。一些收集好的卵子可以用许多不同雄性的精子来受精，动物园和水族馆的种群可以交换精子，我们甚至可以让野生和圈养的个体进行杂交。特别是具有抵抗疾病等有特殊价值的个体，可以在死亡后的很长时间内继续贡献自己的基因。

但是，正如你所想的那样，实际操作比听起来要复杂得多。精子的储存要比卵子更容易，精子冻存的试验已经在越来越多的物种身上取得了成功。Kouba和同事一起创建了美国国家两栖动物基因组库，他表示：“最初精子解冻后恢复活性的概率只有5％，现在可以达到50％至70％。我们还可以保存活体动物体内的精子，并用它们来培育后代。”

而冷冻卵子是另一码事：由于卵子尺寸很大，含有卵黄，水分含量高，并且还有着果冻状厚外层，这些特征导致科学家们至今未能成功将其冷冻。Kouba表示，这个问题必须解决。“冷冻精子确实要简单得多，但如果只能保留雄性基因组，而那只是整个基因组图谱的一半而已。”

建立更多育种项目

到目前为止，尽管需求巨大，但受益于辅助生殖技术的濒危物种数量仍然很少。在某些育种项目中，许多或所有由此产生的后代仍被圈养，以帮助维持人工栖息地的运转。另一些则重新回到了野外：超过30万只波多黎各凤头蟾蜍（Puerto Rican crested toadlets）已被放生到了原本的岛屿，数百只澳洲北部夜宴蛙也回到了属于它们的亚高山沼泽地。Silla在研究过程中培育的所有澳洲北部夜宴蛙都被放生了，对此她感到十分自豪：“我很激动，这不仅是基于实验室的研究，而且是真实的保护行动。”

▲波多黎各凤头蟾蜍。（图片来源：维基百科）

在未来不久，也会出现更加先进的生殖技术，但我们无法很快将其应用于两栖动物的育种工程中。而与此同时，数百种两栖动物正濒临灭绝。Kouba表示：“现在最急切的需求之一就是建立更多的育种项目，以拯救更多的物种。”

有了运气、耐心和其他一些要素，有些物种的数量或许能够自行恢复。但对于其他物种来说，或许仍要寄希望于人类的帮助。“总体而言，与所有受到威胁的两栖动物数目相比，我们所拯救的不过是九牛一毛。”Kouba说，“但是对于我们正在积极研究的那么些蛙和蟾蜍而言，却会产生举足轻重的影响。”

编辑：储舒婷
责任编辑：顾军

来源：环球科学

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